eProtein Discovery系统对于难以在大肠杆菌中表达的蛋白质（如具有毒性、含多个二硫键、包含无序区域或结合伴侣的蛋白），可在体内生产前通过无细胞蛋白质合成（CFPS）优化条件。CFPS可通过测试蛋白质变体优化质粒设计，并辅助大肠杆菌菌株筛选。通过自动化流程，该系统可帮助确定最佳构建体设计（尤其是最优蛋白质变体与可溶性标签）及理想的无细胞混合体系条件，这些参数可直接应用于体内表达，尤其适用于需要特殊折叠环境的蛋白质。

本应用展示了eProtein Discovery系统如何简化从无细胞蛋白质合成到大肠杆菌体内表达的过渡流程，尤其适用于含二硫键的复杂蛋白质。通过筛选多种蛋白质变体及最多7种可溶性标签，该系统实现了构建体的优化设计。在测试的15种蛋白质中，蛋白质二硫键异构酶（PDI）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）成为关键添加剂，可增强二硫键形成并最大化产量。筛选结果与 CFPS 产量高度吻合，验证了系统的稳健性。SHuffle T7 Express 菌株因增强二硫键形成能力（模拟 PDI/GSSG 效应），其结果与 CFPS 相关性最强；而 BL21 (DE3) 菌株及缺乏 PDI/GSSG 时产量较低。该案例研究表明，CFPS 是优化蛋白质表达及指导体内放大生产的有效工具，可减少质粒设计和菌株筛选的迭代次数。该系统最终加速了蛋白质生产，为研究人员提供了获取功能蛋白的可靠方案。

1️⃣eProtein Discovery卡盒筛选

本研究共选择15种蛋白质（含变体）：CD19（21-556）、CD19（21-277）、全长 EPO、EPO（28-192）、IL-2（21-153）、MMP-1（100-469）、MMP-1（101-179）、MSLN（37-606）、MSLN（296-606）、MSLN（296-359）、PDGFR（33-531）、R303、R326、R330和VEGF165。将蛋白质序列进行密码子优化，并在两侧添加3C和TEV序列。优化后的序列通过基因合成获得，利用eGene Prep Kit: Solubility Tag Screen生成整合不同可溶性标签的表达构建体。每个构建体包含用于磁珠纯化的C端Strep标签和用于表达及纯化后定量的检测标签。无细胞核心试剂中添加至多两种添加剂（包括PDI/GSSG），以制备8种无细胞混合体系。

将eGene构建体与无细胞混合体系连同纯化磁珠、对照品和洗脱缓冲液一同加样至筛选卡盒中。通过eProtein Discovery系统自动化运行，可生成并分析192个表达谱。系统在定量后自动筛选表达量最高的eGene/无细胞混合体系组合用于纯化，同步预测放大生产的产量，全部流程在24小时内完成。由于数据量较大，仅报告每种蛋白质最佳预测产量（均包含PDI/GSSG作为添加剂），并以仅添加Buffer的无细胞核心试剂作为对照进行比较。

2️⃣CFPS放大生产

对于每种蛋白质变体，使用放大试剂盒将预测表达量最高的筛选方案进行过夜放大培养，以制备微克级蛋白质。同时，构建体也在添加Buffer/Buffer的无细胞混合体系中表达以作对照。蛋白质定量采用内部荧光检测法，并通过SDS-PAGE验证蛋白质量与纯度。

3️⃣体内放大生产

在体内放大生产中，通过Gibson组装将eGene构建体克隆至pET41a载体，设计引物以扩增载体骨架和eGene插入片段。重组质粒转化至大肠杆菌DH5α细胞进行扩增，通过小量提取分离质粒DNA。随后将质粒转化至 BL21 (DE3)、OrigamiB (DE3) 和SHuffle T7 Express菌株。在含氯霉素（33 μg/mL）的TB培养基中，于37°C（SHuffle 菌株为 30°C）、220 rpm 条件下培养。当OD600超过1时，用0.2 mM IPTG诱导蛋白表达，随后在18°C孵育过夜。

细胞离心沉淀后，使用含蛋白酶抑制剂、T4溶菌酶和 DNase I 的B-PER缓冲液裂解。20°C 孵育20分钟后，取5 μL样品作为总蛋白组分。样品在4°C下以4,500 x g离心60分钟，收集5 μL可溶性组分。蛋白质纯化采用 KingFisher系统，搭配Nuclera专有洗涤缓冲液、链霉亲和素磁珠和洗脱缓冲液。洗脱前收集5 μL上清作为未结合组分。通过内部荧光检测评估蛋白产量，并基于OD600值标准化以消除细胞数量差异的影响。

1️⃣eProtein Discovery卡盒筛选

eProtein Discovery系统用于筛选15种蛋白质或变体，图2报告了预测可溶性蛋白产量最高的eGene构建体与无细胞混合体系组合。本研究选择的蛋白质（如 EPO、VEGF 和 IL-2）均含二硫键，这些化学键对稳定三级结构和确保正确折叠至关重要。类似地，CD19、MSLN 和 PDGFR 等蛋白也依赖二硫键维持结构稳定性和功能构象。然而，二硫键形成可能带来显著挑战，尤其在大肠杆菌等细菌系统中表达蛋白质时。针对上述挑战，PDI/GSSG成为增强二硫键形成的最佳添加剂。

除添加剂筛选外，研究发现蛋白质截短可显著提高可溶性蛋白产量。例如，表达不含信号肽序列的CD19（21-556时，因跨膜结构域的存在，其表达和纯化水平低于仅表达胞外结构域的CD19（21-277），截短处理使预测放大产量提升9.4倍。

第三个关键因素是对特定蛋白质及其变体使用可溶性标签，如CD19（21-556）、CD19（21-227）、PDGFR（33-531）和VEGF165（见图2）。对VEGF165进行带/不带可溶性标签的筛选显示，带标签时预测产量提升2.2倍。同样，对于PDGFR（33-531），使用TRX可溶性标签相比P17标签使预测产量增加2.5倍。

2️⃣CFPS放大生产

eProtein Discovery 筛选的预测产量与 CFPS 放大培养的实际产量具有强相关性（数据未展示），验证了该筛选体系能有效选择适用于大规模蛋白生产的可溶性标签和无细胞混合体系。

下图3展示了MSLN（37-606）、MSLN（296-606）和 MSLN（296-359）的代表性SDS-PAGE图像。对于所有使用Buffer/Buffer生产的MSLN变体，未结合组分中存在明显条带（红色箭头），表明纯化过程中蛋白未与Strep磁珠结合。这提示折叠异常，可能是由于缺乏氧化环境导致二硫键形成不足。相比之下，使用PDI/GSSG+GSSG生产的蛋白无此条带，证实添加剂通过促进二硫键高效形成来驱动正确折叠。

图3：MSLN变体的SDS-PAGE 分析。红色箭头指示纯化过程中未结合组分中的蛋白质，表明存在蛋白质错误折叠，蓝色箭头显示洗脱组分中的纯化蛋白质。

3️⃣体内放大生产

在所有案例中，在OrigamiB (DE3) 和SHuffle T7 Express中表达的含二硫键蛋白质产量显著高于BL21 (DE3)，平均增幅分别达9.7倍和17.1倍（图4）。OrigamiB (DE3) 的性能提升源于 trxB（硫氧还蛋白还原酶）和gor（谷胱甘肽还原酶）基因突变，这些突变创造了促进二硫键形成的氧化细胞质环境。SHuffle T7 Express 通过表达DsbC（一种校正错误折叠蛋白的二硫键异构酶）进一步增强二硫键形成能力，使其对多二硫键蛋白质尤为有效。这表明CFPS筛选是选择最佳体内表达菌株的有效工具，尤其适用于依赖二硫键形成的蛋白质。

图4：体内放大生产。将eGene构建体克隆至pET41a载体，并在BL21 (DE3)、OrigamiB (DE3) 和SHuffle T7 Express菌株中表达。采用内部荧光检测法定量产量，并基于OD600值标准化以校正细胞数量差异。

eProtein Discovery 系统为解决传统基于细胞的蛋白质生产挑战提供了变革性方案，尤其适用于常因二硫键导致错误折叠和低产量的蛋白质。通过将无细胞蛋白质合成（CFPS）与数字微流控技术及自动化集成，该平台可快速优化表达条件，最短48小时内即可生产高质量功能蛋白。更重要的是，它能有效指导体内表达的质粒设计和大肠杆菌菌株筛选，确保从CFPS到体内生产的过渡成功。

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