1）代谢功能检测——葡萄糖摄取实验（Glucose Uptake Assay）

葡萄糖摄取实验主要用于验证药物对胰岛素抵抗细胞的葡萄糖摄取能力的影响，选取糖尿病代谢相关的肌肉/胰岛/脂肪细胞系，评估胰岛素等大分子药物对细胞摄取葡萄糖的效果。其金标准是基于放射性标记的葡萄糖类似物3H-2DG （[3H]-2-脱氧-D-葡萄糖）和 3H-2DG6P（[3H]-2-脱氧-D-葡萄糖-6-磷酸）的检测。但放射性同位素具有一定的局限性，因此目前常用的葡萄糖摄取检测是基于荧光标记的2-NBDG（2-硝基苯并噁二唑-2-去氧-D-葡萄糖）和2DG（2-去氧-D-葡萄糖）进行。

以Abnova的葡萄糖摄取荧光检测试剂盒(2-NBDG)2-NBDG Glucose Uptake Assay试剂盒(KA6077)为例进行简单介绍：

2-NBDG是一种荧光标记的葡萄糖类似物，通过葡萄糖转运蛋白(GLUTs)转运到细胞内，随后C-6位置发生磷酸化而滞留细胞中，形成2-NBDG-6-磷酸(2-NBDG-6-phosphate)，在细胞积累后产生强烈的绿色荧光，因此通过荧光显微镜等方法测量荧光强度可以反应葡萄糖的摄取情况，葡萄糖摄取和荧光信号成正比。该方法操作简单安全，适合进行高通量筛选。

▲ 2-NBDG Glucose Uptake Assay Kit 葡萄糖摄取测定试剂盒（Abnova，KA6077）

泉心泉意云智慧供应链提供多款葡萄糖摄取试剂盒以及检测所用到的肌肉、脂肪胰岛细胞等等，相关产品货号见附录。

2）代谢功能检测——糖原合成试验（Glycogen Synthesis Assay）

糖原合成是胰岛素调节血糖水平的重要机制之一。通过促进糖原合成，胰岛素能够将多余的葡萄糖储存为糖原，从而降低血糖水平。糖原合成试剂盒用于检测胰岛素是否能够促进细胞内糖原的合成。其机制在于胰岛素激活后，通过PI3K-Akt通路（即磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphoinositol-3 kinase，简称PI3K）和蛋白激酶B（Protein kinase B，简称Akt）信号传导通路）抑制糖原合成酶激酶3（GSK-3），从而促进糖原合成酶的活性，增加糖原合成。因此糖原合成试验可以直接反映胰岛素药物是否能够有效促进细胞内糖原的合成，从而评估其降低血糖的能力。

Abnova的糖原检测试剂盒 (KA6573)操作简单且定量准确，可以用于测量生物样本中的糖原水平。

糖原在葡萄糖淀粉酶作用下被水解为葡萄糖，然后葡萄糖被特异性氧化形成葡萄糖酸δ-内酯和过氧化氢（H₂O₂），形成的氧化产物与OxiRed探针（OxiRed是一种可以与过氧化氢反应的化学物质）反应会改变颜色（570nm吸光度增加）或产生荧光（激发光535nm/发射光587nm）。

▲ Abnova的糖原检测试剂盒 (KA6573)数据展示

泉心泉意云智慧供应链提供葡萄糖糖原合成检测试剂盒等，相关产品货号见附录。

3）代谢功能检测——酶抑制实验（Enzyme Inhibition Assay）

在糖尿病药物研究中，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制实验具有重要的意义。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶在碳水化合物的消化过程中起关键作用，抑制它们的活性可以延缓碳水化合物的消化和吸收，从而降低餐后血糖水平。通过测试化合物对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性，筛选出潜在的抗糖尿病药物。酶抑制试验的检测一般基于比色法或荧光法检测酶活性的变化。

以Abnova α-葡萄糖活性检测试剂盒（Alpha-Glucosidase Activity Assay试剂盒，KA1608）为例，简要说明α-葡萄糖苷酶的酶活测定原理：

α-葡萄糖活性检测（alpha-Glucosidase Assay Kit，GAA）的原理是基于GAA酶能够特异性地切割合成的特异性底物4-甲基伞形酮-α-D-葡萄糖苷，从而释放出可被定量的荧光团4-甲基伞形酮(4-Methylumbelliferone)，然后通过荧光强度（激发波长/发射波长 = 368/460 nm）可以进行荧光定量，计算出样本中GAA的活性。

▲ Abnova α-葡萄糖苷酶的酶活测定试剂盒性能（KA1608）

泉心泉意云智慧供应链提供葡萄糖糖原合成检测试剂盒等，相关产品货号见附录。

4）信号传导功能检测——胰岛素受体自磷酸化试验（Insulin Receptor Autophosphorylation Assay）

胰岛素受体的自磷酸化是胰岛素信号传导的“开关”。胰岛素与受体结合后，激活受体的酪氨酸激酶活性，导致受体自身酪氨酸残基的磷酸化，从而启动下游信号通路。通过Western blot检测胰岛素受体的酪氨酸磷酸化水平，可以判断胰岛素药物是否能够有效激活受体。胰岛素受体的激活是胰岛素发挥生理作用的首要条件，因此该结果对于评估胰岛素药物的疗效和安全性具有关键作用。

5） 信号传导功能检测——Akt磷酸化试验（Akt Phosphorylation Assay）

蛋白激酶B（Protein Kinase B，简称PKB），也被称为Akt，是胰岛素信号传导通路中的关键节点蛋白，其磷酸化状态反映了胰岛素信号传导的活跃程度。Akt磷酸化试验用于检测Akt的磷酸化水平，通过Western blot检测Akt/ GSK3的磷酸化水平可以判断胰岛素药物是否能够有效激活PI3K-Akt信号通路，对于评估胰岛素药物在糖尿病治疗中的潜在疗效和作用机制具有重要意义。

泉心泉意云智慧供应链提供胰岛素信号通路磷酸化检测试剂盒等，相关产品货号见附录。

6）细胞分泌功能检测——葡萄糖刺激试验（Glucose-Stimulated Insulin Secretion，GSIS）

胰岛素分泌实验主要用于评估筛选药物对胰岛β细胞胰岛素分泌的影响，以确定其在调节血糖水平中的潜在作用。通过使用胰岛素ELISA或荧光素酶报告基因系统盒等来检测培养基中细胞分泌的胰岛素/C肽含量。ELISA方法灵敏度高，操作简便，但检测成本比较高；荧光素酶报告基因系统相对成本低，比较适合高通量筛选，但是实验过程中需要提供底物。

以Human cell design的人源胰岛β细胞检测筛选化合物胰岛素分泌效果为例，检测实验流程如下：

将胰岛β细胞系培养至对数生长期，确保细胞状态良好使用细胞计数仪或血细胞计数板计数细胞，调整细胞密度。在培养基中添加不同浓度的葡萄糖，设置对照组，低糖刺激组，高糖刺激组，药物处理组等不同的组别，孵育一定时间（通常为1-2小时）后，收集细胞培养上清液，进行胰岛素分泌/C肽检测。

▲ Human cell design EndoC-βH5细胞形态图

以Abnova（Insulin (Human) ELISA Kit, KA3810）的检测试剂盒为例，简述胰岛素的检测流程：

首先，将样本或标准品加入到微孔板的适当孔中，随后加入抗体混合物，将微孔板在室温下孵育1小时，期间使用微孔板振荡器以400rpm/min的速度进行振荡；孵育完成后，用1X洗涤缓冲液（Wash Buffer PT）洗涤每个孔三次，确保完全去除未结合的物质；向每个孔加入TMB（3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine，3,3'5,5'-四甲基联苯胺）显色液，在暗处进行孵育。孵育过程中，TMB在辣根过氧化物酶（HRP）的催化下产生蓝色；加入终止液，使颜色从蓝色变为黄色。使用微孔板读数仪读取吸光度值；通过标准曲线计算样本的胰岛素浓度。将吸光度值与标准曲线进行对比，得出样本胰岛素的浓度。

▲ Abnova 胰岛素检测流程示意图

泉心泉意云智慧供应链提供一系列用于糖刺激试验的胰岛细胞、胰岛素/C肽检测试剂盒，相关产品货号见附录。

7）信号传导功能检测——cAPM分泌实验（Insulin Secretion Assay）

胰岛素分泌与cAMP相关，血糖升高，胰岛β细胞代谢增强，ATP/ADP比值增加，促进AMP生成后，通过PKA等调节导致细胞内钙离子浓度增加，从而促进胰岛素的释放。cAMP的检测可以直接反映药物对于胰岛素的作用效果。通常用不同浓度的糖刺激GLP-1R CHO细胞，模拟胰岛功能，随后通过ELISA等方法检测cAMP的表达水平。

Abcam cAMP 检测试剂盒 （ab138880）使用荧光竞争性酶联免疫吸附测定法(ELISA)定量样本中的cAMP(cAMP)水平，检测原理为：

首先通过将 HRP 标记的 cAMP 和样品中的游离 cAMP 添加到包被有cAMP抗体的96孔板中，然后HRP 标记的 cAMP 和游离 cAMP对cAMP 抗体结合位点进行竞争性结合，洗脱未结合的样本后，通过检测荧光信号的强弱了解cAMP的浓度。样本中存在的cAMP越多，HRP标记的cAMP结合的越少，荧光信号越弱。

▲ Abcam cAMP检测试剂盒检测性能(ab138880)

泉心泉意云智慧供应链提供cAMP检测试剂盒等，相关产品货号见附录。

8）细胞增殖功能检测——细胞增殖/活性实验（Cell Viability Assay）

细胞增殖/活性实验是评估细胞健康状态和药物毒性的重要手段，能够了解药物对细胞生长、代谢和存活的影响，常见的细胞活性实验包括MTT实验，CCK-8实验，MTS实验，XTT实验，荧光素酶报告基因实验等。不同实验基本原理和特点总结如下：

MTT实验：MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）是一种黄色的四氮唑化合物，活细胞中的线粒体脱氢酶可以将其还原为紫色的甲臜（formazan），具有操作简便，成本低，适合高通量筛选的优点，缺点是可能对某些细胞类型不适用。

CCK-8实验： CCK-8试剂中含有WST-8（2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt），在活细胞中被线粒体脱氢酶还原为橙黄色的甲臜，具有灵敏度高，操作简便，适合高通量筛选的优点，但成本相对较高。

MTS实验：MTS（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium）在活细胞中被还原为紫色的甲臜，具有操作简便，适合高通量筛选的优点，缺点是可能对某些细胞类型不适用。

XTT实验：XTT（2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide）在活细胞中被还原为橙黄色的甲臜，具有灵敏度高，适合高通量筛选的优点，可能对某些细胞类型不适用。

荧光素酶报告基因实验：通过荧光素酶（Luciferase）和荧光素（Luciferin）反应产生荧光信号，荧光强度与活细胞数量成正比，优点是灵敏度高，适合高通量筛选，但是需要荧光检测设备，成本较高。

以BPS的One-Step Luciferase Assay System (60690)一步法荧光素酶检测试剂盒为例简要介绍实验原理：

荧光素酶是一类氧化酶的总称，它们催化发出光的反应，这一过程称为生物发光。在荧光素酶反应中，细胞用含有 D-荧光素的荧光素酶底物裂解。在报告细胞中表达的萤火虫荧光素酶使用 ATP 作为共底物在 Mg 存在下催化 D-荧光素转化为氧化荧光素²⁺，在发出光的反应中。光的量与反应中存在的荧光素酶的量成正比。使用光度计读取发光。

▲ BPS一步法荧光检测试剂盒（60690）

泉心泉意云智慧供应链提供一系列细胞增殖/活性检测试剂盒，相关产品货号见附录。

药效学研究可以验证糖尿病大分子药物与目标受体结合的能力，从而确定药物的有效性、药物的作用强度以及特点，除了在体外细胞水平开展相关实验外，通过动物模型进一步验证该药物的安全有效性也是药物研发的重要阶段，更多信息，我们下期再见。

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